近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所作物有害生物功能基因組研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)與俄亥俄州立大學(xué)、孟加拉國(guó)謝赫穆吉布拉赫曼農(nóng)業(yè)大學(xué)、巴西圣卡洛斯聯(lián)邦大學(xué)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部合作開發(fā)出一種檢測(cè)田間麥瘟病發(fā)生的新方法，該方法不依賴實(shí)驗(yàn)室PCR儀等專業(yè)設(shè)備，實(shí)現(xiàn)了麥瘟病的田間快速核酸檢測(cè)。通過與巴西、孟加拉國(guó)等合作單位對(duì)早期侵染材料進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該方法比傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)靈敏度更高。相關(guān)研究成果在線發(fā)表在《工程院院刊（Engineering）》上。
圖1分析流程圖：1，對(duì)兩個(gè)麥瘟菌基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝、注釋，
并與3個(gè)已發(fā)表的稻瘟菌基因組進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，找出在兩個(gè)麥瘟菌中均存在、在稻瘟菌中均不存在的基因；
2，將獲得的基因比對(duì)到NCBI基因庫(kù)，進(jìn)一步去除稻瘟菌中的基因，共篩選出100個(gè)麥瘟菌基因；
3，將這100個(gè)基因比對(duì)到更多的已發(fā)表的麥瘟菌和稻瘟菌基因組，
最終獲得2個(gè)麥瘟菌中穩(wěn)定存在，而水稻稻瘟菌中不存在的基因。
據(jù)康厚祥副研究員介紹，1985年，麥瘟病首次在南美洲爆發(fā)，該病發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可造成高達(dá)100%的小麥產(chǎn)量損失。麥瘟病病原為稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）的小麥致病型，也稱麥瘟菌。麥瘟菌菌絲、孢子的外觀形態(tài)與水稻稻瘟菌完全一致，兩者基因組DNA序列整體一致性也超過99%。然而，麥瘟菌對(duì)小麥的整體侵染能力比水稻稻瘟菌對(duì)水稻的侵染能力更強(qiáng)，且麥瘟菌廣泛對(duì)嘧菌酯、醚菌酯等QoI類殺菌劑具有較強(qiáng)的抗藥性和耐藥性。目前研究發(fā)現(xiàn)，小麥種質(zhì)資源中只有2N片段、Rmg2、Rmg3、Rmg7和Rmg8等少數(shù)抗病區(qū)段和基因，除Rmg8外，其余抗病基因的抗性均已被麥瘟菌克服或?qū)λ腩i瘟無效。麥瘟病于2016年進(jìn)入南亞孟加拉國(guó)并爆發(fā)，給當(dāng)?shù)匦←溕a(chǎn)造成毀滅性打擊，麥瘟病進(jìn)入亞洲后，其菌絲或孢子隨氣流、種子等媒介進(jìn)入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增加。因此，開發(fā)出準(zhǔn)確的麥瘟菌檢測(cè)技術(shù)對(duì)準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)預(yù)警、及時(shí)阻斷其可能的入侵具有重要意義。
圖2利用特異性引物可準(zhǔn)確檢測(cè)麥病侵染。（a）：侵染14天后的病斑；
（b）：小麥穗頸瘟田間照片；（c）：利用基因特異引物檢測(cè)麥瘟菌侵染
（2,3,4分別為麥瘟菌絲正對(duì)照、葉瘟、穗頸瘟，5,6為兩個(gè)稻瘟菌對(duì)照）。
圖3 整合Cas12a、RPA和NALFIA技術(shù)快速檢測(cè)麥瘟病。
?。╝）：檢測(cè)流程示意圖，將待檢測(cè)材料（可為經(jīng)過簡(jiǎn)易DNA提取的田間材料）通過RPA特異性的擴(kuò)增，
然后再利用Cas12a特異性的識(shí)別目的DNA片段，成功識(shí)別到目的片段后激活Cas12a的非特異性單鏈切割活性，
通過第二輪RPA來檢測(cè)溶液中的隨機(jī)探針是否準(zhǔn)確被切割，
然后通過NALFIA在檢測(cè)試紙上準(zhǔn)確顯示出檢測(cè)結(jié)果；（b）：按流程準(zhǔn)確檢測(cè)和區(qū)分MoT和MoO。
圖4 對(duì)Cas12a-RPA-NALFIA 結(jié)合檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度測(cè)試。普通PCR檢測(cè)在DNA濃度降低到10-3-10-4（ng/μL）時(shí)，
難以準(zhǔn)確檢測(cè)到目的條帶（圖 左上）；而Cas12a-RPA-NALFIA技術(shù)能在DNA濃度降低到10-3-10-4（ng/μL）時(shí)，
快速準(zhǔn)確檢測(cè)到目的條帶（圖 左下）。同時(shí)，模擬田間侵染情況下普通PCR檢測(cè)至少需要在侵染后第4天才能檢測(cè)到目的條帶（圖 右上）；
而Cas12a-RPA-NALFIA技術(shù)最快能在侵染后第2天便準(zhǔn)確檢測(cè)到目的條帶（圖 右下）。
該團(tuán)隊(duì)與巴西合作，從田間分離出麥瘟菌并對(duì)其中兩個(gè)菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序和序列分析；通過與已公布的大量稻瘟基因組進(jìn)行比較基因組學(xué)分析并找出了麥瘟菌特異的DNA序列；結(jié)合RPA、Cas12a、NALFIA等技術(shù)開發(fā)出了田間快速檢測(cè)方法并在孟加拉國(guó)進(jìn)行測(cè)試。傳統(tǒng)PCR核酸檢測(cè)方法在麥瘟菌侵染后第4天才能被檢測(cè)到，而該方法在侵染后第2天便能準(zhǔn)確檢測(cè)到麥瘟菌侵染，表現(xiàn)出更高的靈敏度。同時(shí)，該方法還能明確區(qū)分種內(nèi)不同致病型，表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性和特異性。
據(jù)了解，該研究得到中國(guó)農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程等資助。
